الملخص:
لقد ثبت أن الالتهاب يلعب دورًا مهمًا في التسبب في السكتة الدماغية الإقفارية. كما وجد أن استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة كمشارك رئيسي في الالتهاب الذي أعقب السكتة الدماغية كان سبباً في حدوث السكتة الدماغية. هدفت هذه الدراسة إلى بحث تأثير غاز النانو هيدروجين على استقطاب الخلايا البلعمية والخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، حيث تمت معالجة خلايا الـ (Raw264.7) مع السكرياتيدات متعددة الدهون ومن ثم تتعرض للهيدروجين، وتمت معالجة الخلايا الدبقية مع طافٍ من الخلايا العصبية المعالجة بالأكسجين والجلوكوز ثم تعريضها للهيدروجين. وتم تحديد الأنماط الظاهرية للخلايا Raw264.7 والخلايا الدبقية الصغيرة بواسطة قياس التدفق الخلوي وتم ملاحظة مورفولوجيا الخلية. وأظهرت النتائج زيادة كبيرة للخلايا البلعمية M1 في السكرياتيدات متعددة الدهون وطائفات من الأكسجين والجلوكوز المعالج بالمنع بالخلايا العصبية رفعت بشكل كبير نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة M1 ولكن كلا العلاجين كان لهما تأثير بسيط واضح على الخلايا M2. بالإضافة إلى ذلك فقد أظهرت المعالجة بالنانو هيدروجين منع زيادة الخلايا M1 بشكل كبير ولكن لم يكن لها تأثير على خلايا M2. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن العصبية من النانو هيدروجين قد تكون مرتبطة بتنظيم الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي بعد السكتة الدماغية.
الكلمات المفتاحية: الخلايا البلعمية – الخلايا الدبيقية- الاستقطاب – التهاب هيدروجين – السكتة الدماغية.
————————–
المقدمة:
تعتبر السكتة الدماغية من أكثر الاضطرابات العصبية شيوعًا والسبب الثاني الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، ويمكن تقسيم السكتة الدماغية إلى نوعين سكتة دماغية إقفارية وسكتة دماغية نزفية، وأن النوع الإقفاري من السكتات الدماغية يكون ناتج عن العديد من العمليات المسببة للأمراض لحوالي 87٪ من المرضى المصابين بالسكتات الدماغية. وقد تم التأكد من أن نقص التروية (في الدماغ يمكن أن يسبب الموت العصبي بسبب منع الأكسجين والطاقة وتراكم الكالسيوم داخل الخلايا وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية وضعف الميتوكوندريا والالتهاب.
وقد اقترحت الدراسات الأساسية والسريرية أن الفسيولوجيا المرضية للسكتة الإقفارية ترتبط ارتباطًا وثيقًا بحدوث الالتهاب حيث تلعب الخلايا الدبقية والبلعمية في الجهاز العصبي المركزي دورًا هامًا في ذلك.
وللخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية أصول خلوية مختلفة، حيث تنبع الخلايا الدبيقية الصغيرة من الظهارة العصبية وتعبر عن مستويات عالية من مستقبل الكيموكين1 CX3C (CX3CR1) ومجموعة التمايز(CD) 11b و F4/80 ومستوى منخفض من الـ (CD45) ومستقبل الكيموكين من النوع الثاني (CCR2) وفي المقابل تنشأ الخلايا البلعمية من الخلايا الجذعية المكونة للدم وتعبر الخلايا الوحيدة والخلايا البلعمية الالتهابية عن مستويات عالية من CCR2 و CD11b و Ly6C ، ولكنها منخفضة في مستوى CX3CR1. وفي وجود الالتهاب يمكن تنشيط الخلايا الدبيقية الموجودة في الدماغ والخلايا البلعمية بواسطة السيتوكينات.
في السنوات الأخيرة كشفت الدراسات أن الخلايا النشطة يمكن تصنيفها بشكل إضافي وفقًا لوظائفها المتخصصة. وبشكل عام يتم تصنيف الخلايا الدبيقية إلى؛ النوع النظامي (وهي خلايا تساعد على حدوث الالتهاب مثل الخلايا M1) والنوع البديل (وهو مضاد للالتهابات أو وقائي مثل الخلايا M2).
وقد تتسبب الخلايا الدبيقية من النوع (M1) في زيادة الالتهاب وتسبب إصابة الأنسجة عن طريق إفراز بعض السيتوكينات المؤدية للالتهاب (مثل الإنترلوكين IL -1β، وعامل نخر الورمα ، IL-12 ، IL-23 ، وأول أكسيد النيتروجين) ، وقد يؤدي ممارسة التأثيرات التهابية إلى أن الخلايا M2 الدبيقية تعمل على وقف الالتهاب وتعزيز انتعاش الأنسجة عن طريق إفراز بعض السيتوكينات المضادة للالتهابات (مثل IL-4 ، IL-10 ، IL-13 وعامل النمو المحول β). وعلى غرار الخلايا الدبقية يمكن أن تستقطب الخلايا البلعمية أيضًا أنماطًا مصلية تشبه M1 أو M2.
وفي وجود الإنترفيرونات من الخلايا التائية المساعدة، فإن السكرياتيدات متعددة الدهون أو نمط الضرر المصاحب بالجزيء والخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية تخضع إلى تنشيط في شكل M1، وقد تحث IL-4 / IL-13 على تنشيط في شكل M2 للخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية. وتتميز الاستجابات لشكل M1 بالتنظيم المتطور لـ IL-1β وعامل نخر الورمα وإنزيم سينثاز أكسيد النيتريك المحرض من خلال مستقبل Toll-like 4، واستجابات الـ M2 للتنظيم التصاعدي لإنزيم أرجينازـ CD206 ، CD163 ، IL-4 ، IL-10، وعامل النمو المحول β من خلال تنشيط الخلايا النخاعية. وتشير الدراسات الحديثة إلى أن الخلايا البلعمية M1 يمكن أن تتحول نحو النمط الظاهري للخلايا البديلة النشطة M2 للبلعمة النشطة.
وتكون هذه الفكرة أكثر إقناعا للخلايا البلعمية من الخلايا الدبقية القائمة على وظيفة الخلايا البلعمية وحيدة النواة. النانو هيدروجين هو أبسط جزيء في الطبيعة عديم اللون والرائحة. وبشكل تقليدي يتم استخدام النانو هيدروجين كغاز خامل من الناحية الفسيولوجية في التعمق للوقاية من تخدير النيتروجين لأنه قد لا يتفاعل مع مكونات الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك يمكن أيضًا إنتاج النانو هيدروجين في الأمعاء البشرية ثم طرده عن طريق التنفس.
ولذلك يتم استخدام تركيز النانو هيدروجين من غاز الزفير في تشخيص بعض أمراض الجهاز الهضمي. وفي السنوات الأخيرة تؤكد الدراسات المتزايدة أن النانو هيدروجين يمكن أن يمارس تأثيرات مضادة للأكسدة ومضاد للالتهاب ومضادة لموت الخلايا على مجموعة متنوعة من الأمراض وحيث أن أوهساوا وآخرون ذكرت أن استنشاق النانو هيدروجين يمكن أن يحمي الدماغ ضد إصابة نقص التروية الدماغية عن طريق تحييد انتقائي لشوارد الهيدروكسيل و البيروكسنيتريت. ومع ذلك لا تزال آثار النانو هيدروجين على استقطاب الخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية غير واضحة.
وقد أجريت هذه الدراسة لبحث آثار غاز النانو هيدروجين على استقطاب الخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية في المختبر والتي قد توفر آلية جديدة لنشاط النانو هيدروجين المضاد للالتهاب.
المواد والأساليب
الحيوانات
تم شراء الفئران الأم من مركز الحيوان التجريبي التابع للجامعة الطبية البحرية في شنغهاي بالصين (رقم A2015-011) وحفظها في دورة ضوء وإظلام 12/12 وفي درجة حرارة 25 درجة مئوية وتم إعطائها حرية الوصول إلى الماء والغذاء، وتم التضحية بعدد (30 فأر) من الفئران حديثي الولادة سواء كانوا ذكورا أو إناثا في يوم واحد بعد الولادة. وكان كان متوسط وزن الجسم للفئران حديثي الولادة 2.01±0.21جرام، وتمت التضحية هذه للفئران حديثي الولادة من أجل جمع الخلايا الدبيقية والخلايا العصبية الحصينية الأساسية، وتمت الموافقة على بروتوكول الدراسة هذا من قبل لجنة الأخلاق بجامعة الطب البحرية بشنغهاي في الصين (ورقم الموافقة: 20170236).
فصل الخلايا والاستنبات والمراقبة
تم تخدير الفئران حديثي الولادة بمادة ثنائي إيثيل الإيثر، وتم حصاد جذع الدماغ أو أنسجة الحصين وغسلها بمحلول ملحي مخفف من الفوسفات، ثم بعد ذلك تم هضم الأنسجة في الكولاجيناز 0.5 ٪ (سيجما وسانت لويس إم أو، الولايات المتحدة الأمريكية) في درجة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم تم فصل الخليط بواسطة شفطه بالماصة ومن ثم نقله إلى أنبوب طرد مركزي معقم.
تم إضافة وسط من مادة DMEM / F12 بالكامل (يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني 100 بنسيل / 100 مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتوميسين؛ ميرك ميليبور، ألمانيا) وذلك لإيقاف عملية الهضم ثم طرد الناتج المعلق بقوة 1000× جم لمدة 5 دقائق (جهاز طرد مركزي منخفض السرعة – TDZ4B-WS؛ من شركة لو إكسيانجاي المحدودة، شنغهاي، الصين). تمت إزالة المادة الطافية وتمت إعادة تعليق الخلايا المتبقية باستخدام وسط الـ DMEM (هايكولون، لوجان، يوتا، الولايات المتحدة الأمريكية) التي تحتوي على 20٪ من مصل بقري جنيني (الهايكولون) ثم بعد ذلك تم زرعها في قوارير.
تم حفظ خلايا الـ Raw264.7 من قبل مختبر الطب البحري (في شنغهاي، الصين) حيث تم استزراعها في وسط الـ DMEM المضاف إليه المصل البقري الجنيني بنسبة20٪، ثم تم حفظ جميع الخلايا في الحضانة (XBQ-3H ، Hualida Experiment Equipment Co.، Ltd. ، Taicang ، الصين) عند 37 درجة مئوية في بيئة ترطيب مع 5 ٪ CO2. تم تحديث الوسيطة مرة كل 2-3 أيام. لتقييم الآثار الوقائية للهيدروجين ، لوحظت الضامة في 24 ساعة و 72 ساعة و 5 أيام (لايكا DMI3000B ، ألمانيا).
وقد خضع إنشاء نموذج الخلايا العصبية للأكسجين والحرمان من الجلوكوز وجمع المواد الطافية للخلايا العصبية الرئيسية الحصينية الخاصة بالفئران للحرمان من الجلوكوز على النحو التالي: بعد 5 أيام من الاستزراع، تم جمع الخلايا العصبية الأولية مع 90٪ محتشدة بعد إجراء الطرد المركزي لها، ومن ثم تم حفظها في محلول ملحي متوازن (الهايكولون) في حاضنة تحتوي على 5٪ أكسجين و 95٪ نيتروجين في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، وتم جمع المواد الطافية لمعالجة الخلايا الدبيقية الأولية.
تجميع العينات
تم تقسيم الخلايا الدبيقية إلى أربع مجموعات: المجموعة الضابطة (الخلايا الدبيقية الصغيرة) ومجموعة النانو هيدروجين (حيث فيها تعرضت الخلايا الدبيقية إلى النانو هيدروجين بنسبة 60٪ لمدة 24 ساعة)، ومجموعة الحرمان من الجلوكوز (حيث تعرضت الخلايا الدبيقية الصغيرة إلى المادة الطافية من الخلايا العصبية المعالجة بالسكر الجلوكوز لمدة 24 ساعة) ومجموعة الحرمان من الجلوكوز + مجموعة النانو هيدروجين (حيث تعرضت فيها الخلايا الدبيقية إلى المادة الطافية من الخلايا العصبية المعالجة من الحرمان من الجلوكوز وإلى النانو هيدروجين بنسبة 60٪ في وقت واحد لمدة 24 ساعة).
تم تقسيم خلايا الـ (Raw264.7) إلى ثلاث مجموعات: مجموعة ضابطة (خلايا Raw264.7 طبيعية) ومجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون (حيث تتعرض الخلايا Raw264.7 إلى 1 ميكروجرام/مل من السكرياتيدات متعددة الدهون [سيجما الدريخ، سانت لويس ، أم أو، الولايات المتحدة الأمريكية] لمدة 24 ساعة)، وفي مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + مجموعة النانو هيدروجين (تتعرض الخلايا الـ (Raw264.7) إلى 1 ميكروجرام / مل من السكرياتيدات متعددة الدهون وإلى 60٪ من النانو هيدروجين في وقت واحد لمدة 24 ساعة).
التعرض لغاز النانو هيدروجين
وبالنسبة للعلاج بالنانو هيدروجين تم زراعة الخلايا في حاضنة مليئة بالنانو هيدروجين بنسبة 66.7٪ و 33.3٪ من الأكسجين الذي قد تم إنتاجه من جهاز إنتاج النانو هيدروجين (المنتج مع منتج النانو هيدروجينAMS-H-01) )، شنغهاي، الصين)، والذي تم تصميمه لتحليل المياه لإنتاج خليط الغاز، وتم تعريض الخلايا لغاز النانو هيدروجين لمدة 24 ساعة.
التدفق الخلوي (تعداد الخلايا بالجريان)
ويوجد هناك أدلة تظهر أن الالتهاب قد بلغ ذروته في 24 ساعة بعد السكتة الإقفارية. لذلك تم جمع خلايا الـ (Raw264.7) في كل مجموعة خلال الـ 24 ساعة والـ72 ساعة و 5 أيام، وتم جمع الخلايا البلعمية خلال 24 ساعة وتم غسل الخلايا بمحلول الفوسفات الملحي المخفف البارد ثلاث مرات ثم إجراء الطرد المركزي لها، وتمت إزالة المادة الطافية وتم إعادة تعليق الخلايا في محلول ملحي مخفف بالفوسفات بكثافة 1 × 105 خلية/مل.
وبعد ذلك تم تثبيت الخلايا في واقي تثبيت في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم إجراء الطرد المركزي عند 1000×جرام لمدة 5 دقائق. وبعد غسل الخلايا في ألبومين المصل البقري بنسبة 2٪ تم تحضين الخلايا في الظلام بالأجسام المضادةCD11b-FITC من شركة (بيوليجيند، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) والأجسام المضادةCD16 / 32-PE من شركة بيوليجيند لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 4 درجة مئوية للخلايا البلعمية M1؛ وتم تحضين الخلايا في الظلام بالأجسام المضادة CD11b-FITC و CD206-APC من شركة بيوليجند لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية للخلايا البلعمية M2. وبعد غسل الخلايا في ألبومين المصل البقري بنسبة 2٪ تم تعليق الخلايا في 300ميكرولتر من محلول الفوسفات المخفف ومن ثم تم جمعه لقياس التدفق الخلوي (B & D للعلوم البيولوجية، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية).
التحليل الإحصائي
تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج سيجمابلوت11.0 (شركة سيستات للبرمجيات، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). يتم التعبير عن البيانات كمتوسط الانحراف المعياري ±، وتم إجراء المقارنات مع تحليل التباين أحادي الاتجاه بين المجموعات متبوعاً باختبار كيولس نيو مان للطالب، والذي فيه تعتبر القيمة (P<0.05) ذات دلالة إحصائية.
النتائج
مورفولوجيا الخلايا ومعدل النمو
كما هو مبين في الشكل 1 نرى أنه قد نمت خلايا الـ (Raw264.7) الطبيعية مع التمسك الثابت وانتشرت بسرعة وكانت مستديرة الشكل. وبعد معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون، أصبحت معظم الخلايا Raw264.7 في شكل مغزلي، وتراجع معدل النمو مع مرور الوقت، وتم عد الخلايا أيضاً. وفي اليوم الثالث زاد عدد خلايا الـ(Raw264.7) بشكل ملحوظ في مجموعة الضابطة (بمعدل النمو: 95.40 ٪)، إلا أن نمو الخلايا في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون انخفض بشكل كبير إلى (20.51٪) بالمقارنة مع نسبة نمو الخلايا في المجموعة الضابطة (P <0.05).
وفي اليوم الخامس كان نمو الخلية في المجموعة الضابطة 1.9 مرة لليوم الثالث، وظل نمو الخلايا في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون عند مستوى منخفض (أي بنسبة 27.66٪، P<0.05، مقابل المجموعة الضابطة). في وجود النانو هيدروجين بنسبة 60٪ خلال معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون، ظلت مورفولوجيا الخلية دون تغيير نسبي واستعادت أيضاً معدل النمو بشكل جزئي أيضا. وكان عدد الخلايا في اليوم الثالث 2.85 مرة مثل اليوم الأول وكان عدد الخلايا باليوم الخامس 1.17 مرة مثل اليوم الثالث (P <0.05 ، مقابل المجموعة الضابطة؛ P <0.05 مقابل مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون). وقد لوحظ أن معدل نمو الخلايا في اليوم الخامس في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + النانو هيدروجين أقل من مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون، على الرغم من أن إجمالي عدد الخلايا في اليوم الخامس في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + النانو هيدروجين كان لا يزال أكبر مما كان عليه في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون.
النمط الظاهري للخلية Raw264.7
في المجموعة الضابطة ظلت نسبة الخلايا البلعمية (M1) مستقرة في فترات زمنية مختلفة (الشكل2). وعلى الرغم من أنه قد تم زيادة معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون بشكل كبير زادت نسبة الخلايا البلعمية (M1) بناء على الوقت (P<0.05، مقابل المجموعة الضابطة). في وجود النانو هيدروجين مع معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون وجد أن نسبة الخلايا البلعميةM1 قد انخفضت بشكل ملحوظ عند مقارنتها بمجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون(P<0.05) من اليوم الأول فضلا عن أنه لم يكن هناك اختلافات واضحة في نسبة الخلايا البلعمية (M1) بين المجموعة الضابطة ومجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + النانو هيدروجين (P>0.05)، على الرغم من أن نسبة الخلايا البلعمية (M1) في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + مجموعة النانو هيدروجين كانت أقل مما كانت عليه في المجموعة الضابطة.
وانخفضت نسبة الخلايا البلعمية (M2) في المجموعة الضابطة مع مرور الوقت وانخفضت أيضا في معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون نسبة الخلايا البلعمية (M2) [P<0.05، مقارنة بالمجموعة الضابطة) (الشكل 3). ومع ذلك فإن إضافة غاز النانو هيدروجين أثناء معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون لم تنجح في زيادة نسبة الخلايا البلعمية (M2) إلى المستوى الطبيعي (P <0.05، مقارنة بالمجموعة الضابطة)، ولم يكن هناك اختلافات واضحة بين مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون ومجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون+ النانو هيدروجين. بالإضافة إلى أنه قد انخفضت نسبة الخلايا البلعمية (M2) مع مرور الوقت في جميع المجموعات.
النمط الظاهري للدبيقات
في المجموعة الضابطة كانت نسبة الخلايا الدبيقية (M1) منخفضة نسبيًا عند 24 ساعة (كما في الشكلان 4 و 6)، وظلت عند مستوى منخفض في مجموعة النانو هيدروجين (P> 0.05). ومع ذلك فإن الطائفات من الخلايا العصبية المعالجة بالحرمان من الأكسجين والجلوكوز أظهرت زيادة كبيرة في نسبة الخلايا الدبيقية (M1) بها مقارنة بالمجموعة الضابطة (P <0.05)، وفي وجود النانو هيدروجين أثناء العلاج الطافٍ انخفضت نسبة الخلايا الدبيقية (M1) إلى المستوى الطبيعي تقريبا مقارنة بالمجموعة الضابطة (P> 0.05).
ظلت نسبة الخلايا الدبيقية (M2) مستقرة في كل مجموعة ولم يكن هناك اختلافات إحصائية بين المجموعات التجريبية والمجموعة الضابطة (كما هو موضح في الشكل 5 و 6). ومع ذلك، فإن نسبة الخلايا الدبيقية (M2) تميل إلى الزيادة في مجموعة المعالجة بالحرمان من الأكسجين والجلوكوز وبدا أنه ينخفض في مجموعة النانو هيدروجين، وانخفضت نسبة الخلايا البلعمية (M2) قليلا عند إضافة النانو هيدروجين أثناء العلاج بالحرمان من الأكسجين والجلوكوز.
المناقشة
إن السكتة الدماغية هي حالة طبية طارئة قد تتسبب في عجز عصبي مدمر. وحتى الآن كانت السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي للوفاة والإعاقة للبالغين في جميع أنحاء العالم. وعلى الرغم من أن المسبب المرضي في السكتات الدماغية معقد (وهو نوع رئيسي من السكتة الدماغية)، فقد أكدت بعض الدراسات على أهمية دور الالتهاب في التسبب في السكتة الدماغية الإقفارية. وتساهم الاستجابة للالتهاب في إحداث أضرار عصبية ثانوية والتي تمارس تأثيراً جوهرياً على كل من الإصابات بالسكتات الدماغية الإقفارية الحادة والتعافي المستمر لوظيفة الدماغ، وإن الالتهاب الناتج عن نقص التروية بالدماغ لديه تدخل لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البلعمية أحاديات الخلايا المشتقة في الجهاز العصبي المركزي، حيث أن الخلايا الدبقية هي الخلايا المناعية الموجودة في الدماغ.
فبمجرد حدوث نقص التروية الدماغية يتم تنشيط الخلايا الدبقية لإنتاج كل من وسائط الوقاية العصبية والوسائط الضارة ويحدد توازن الوسائط المختلفة مصير الأعصاب المصابة، ويعرف تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بالخلايا النظامية (M1) أو البديلة (M2)، والتي تتوافق مع التأثيرات الضارة والوقائية لهذه الخلايا على التوالي. وفي هذه الدراسة تم تناول الخلايا البلعمية والخلايا الدبقية الصغيرة بشكل مستقل. وتم استخدام غاز النانو هيدروجين كغاز خامل من الناحية الفيزيائية في الدراسة المتعمقة ولكن كشفت الدراسات المتزايدة في السنوات الأخيرة عن أن غاز النانو هيدروجين له بعض الأنشطة الفسيولوجية يمكن أن تحدث تأثيرات وقائية لمجموعة متنوعة من الأمراض. على الرغم من أن التأثير المضاد للالتهاب للهيدروجين قد تم فحصه في العديد من النماذج إلا أن آلية عمله المحددة لا تزال غير مفهومة.
يرتبط استقطاب الخلايا البلعمية ارتباطا وثيقا بحدوث الالتهاب ولكن هناك نقص في الأبحاث حول دور النانو هيدروجين في استقطاب الخلايا البلعمية. وفي هذه الدراسة تم بحث آثار النانو هيدروجين على استقطاب الخلايا البلعمية والخلايا الدبقية الصغيرة (والذين يعدو من أهم المشاركين في حدوث السكتة الدماغية الإقفارية). وقد استخدمت معالجة الخلايا البلعمية بالسكريات متعددة الدهون كنموذج التهاب قياسي.
وأظهرت النتائج زيادة كبيرة في نسبة الخلايا البلعمية (M1) في السكاريدات متعددة الدهون وانخفاض في الخلايا البلعمية (M2) في نفس الوقت ولكن النانو هيدروجين استطاع أن يقلل بشكل ملحوظ من الخلايا البلعمية (M1) من اليوم الأول وكان له تأثير ضئيل على الخلايا البلعمية (M2).
وتشهير هذه النتائج إلى أن السكرياتيدات متعددة الدهون قد تنشط الخلايا البلعمية والتي تتميز بزيادة في الخلايا البلعمية (M1) السابقة للالتهابات، ولكن لها تأثير ضئيل على الخلايا البلعمية المضادة للالتهابات (M2). وهذا بالإضافة إلى أن المعالجة بالنانو هيدروجين وحده ليس له أي تأثير على استقطاب الخلايا البلعمية.
وهذا هذه يشير إلى أن النانو هيدروجين يؤثر فقط على النمط الظاهري للخلايا البلعمية تحت الحالة المسببة للمرض، ويعزي الانخفاض في الخلايا البلعمية (M1) إلى تثبيط نشاط الخلايا البلعمية ولكن بدون تحول من النمط الظاهري M2 إلى النمط الظاهري M1.
ويوجد هناك أدلة تظهر أهمية التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا العصبية و الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق السكتة الدماغية الإقفارية. وقد وجد إنوز وآخرون بأن السكرياتيدات متعددة الدهون من الخلايا العصبية المجاورة يمكنها تنشيط الخلايا البلعمية في منطقة السكتة الدماغية الإقفارية.
وأظهرت دراسة زهاو وآخرون بأن الإنترليوكين-4(IL-4) من الخلايا العصبية بمثابة مغير لمسارات الخلايا البلعمية وهكذا فإن الخلايا الدبقية المعرضة للمادة الطافية من الخلايا العصبية المعالجة بمنع الأكسجين والجلوكوز كانت بمثابة نموذج للإصابة بنقص تروية الدماغ في هذه الدراسة. وقد أظهرت نتائجنا أن المادة الطافية من الخلايا العصبية المعالجة بالأكسجين والجلوكوز يمكن أن تزيد من نسبة الخلايا البلعمية (M1)، ولكن في نفس الوقت يثبط العلاج بالنانو هيدروجين زيادة هذه الخلايا. ومع ذلك لم يكن للمادة الطافية والنانو هيدروجين تأثير كبير على الخلايا البلعمية (M2).
وكانت لهذه الدراسة العديد من القيود؛ أولا تم استخدام السكريدات متعددة الدهون لتحفيز الخلايا البلعمية كما في النموذج الالتهابي، والتي قد تختلف في الجسم الحي وبالتالي سيتم حل نقص أبحاث الأجسام الحية في المستقبل. وفي دراستنا هذه قمنا باستخدام خطوط الخلايا ولكن ليس الخلايا البلعمية الرئيسية وكشفنا فقط الخلايا الدبقية في 24 ساعة.
يمكن أن تزيد السكريدات متعددة الدهون بشكل كبير من الخلايا البلعمية المسببة للالتهاب ويمكنها رفع نسبة الخلايا البلعمية المسببة للالتهاب في طافيات الخلايا العصبية المعالجة بمنع الأكسجين والجلوكوز، ولكن كلا من العلاجين لهما تأثيرا ضئيلاً على الخلايا البلعمية المضادة للالتهاب. بالإضافة إلى أن المعالجة المتزامنة بالنانو هيدروجين تثبط زيادة الخلايا البلعمية المسببة للالتهابات وليس لها أي تأثير على الخلايا المضادة للالتهاب.
وهذا يوفر آلية جديدة للتأثير المضاد للالتهابات الخاص بالنانو هيدروجين. ومع ذلك، هناك حاجة لمزيد من الدراسات لتأكيد النتائج التي توصلنا إليها والتحقق أكثر في المسارات المحددة الكامنة وراء الاستقطاب المنظم للهيدروجين للخلايا البلعمية.
ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ
المصدر : مجلة أبحاث الغاز الطبي
الموقع : http://www.medgasres.com
رابط البحث :http://www.medgasres.com/article.as...ume=8;issue=4;spage=154;epage=159;aulast=Ning
لقد ثبت أن الالتهاب يلعب دورًا مهمًا في التسبب في السكتة الدماغية الإقفارية. كما وجد أن استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة كمشارك رئيسي في الالتهاب الذي أعقب السكتة الدماغية كان سبباً في حدوث السكتة الدماغية. هدفت هذه الدراسة إلى بحث تأثير غاز النانو هيدروجين على استقطاب الخلايا البلعمية والخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، حيث تمت معالجة خلايا الـ (Raw264.7) مع السكرياتيدات متعددة الدهون ومن ثم تتعرض للهيدروجين، وتمت معالجة الخلايا الدبقية مع طافٍ من الخلايا العصبية المعالجة بالأكسجين والجلوكوز ثم تعريضها للهيدروجين. وتم تحديد الأنماط الظاهرية للخلايا Raw264.7 والخلايا الدبقية الصغيرة بواسطة قياس التدفق الخلوي وتم ملاحظة مورفولوجيا الخلية. وأظهرت النتائج زيادة كبيرة للخلايا البلعمية M1 في السكرياتيدات متعددة الدهون وطائفات من الأكسجين والجلوكوز المعالج بالمنع بالخلايا العصبية رفعت بشكل كبير نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة M1 ولكن كلا العلاجين كان لهما تأثير بسيط واضح على الخلايا M2. بالإضافة إلى ذلك فقد أظهرت المعالجة بالنانو هيدروجين منع زيادة الخلايا M1 بشكل كبير ولكن لم يكن لها تأثير على خلايا M2. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن العصبية من النانو هيدروجين قد تكون مرتبطة بتنظيم الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي بعد السكتة الدماغية.
الكلمات المفتاحية: الخلايا البلعمية – الخلايا الدبيقية- الاستقطاب – التهاب هيدروجين – السكتة الدماغية.
————————–
المقدمة:
تعتبر السكتة الدماغية من أكثر الاضطرابات العصبية شيوعًا والسبب الثاني الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، ويمكن تقسيم السكتة الدماغية إلى نوعين سكتة دماغية إقفارية وسكتة دماغية نزفية، وأن النوع الإقفاري من السكتات الدماغية يكون ناتج عن العديد من العمليات المسببة للأمراض لحوالي 87٪ من المرضى المصابين بالسكتات الدماغية. وقد تم التأكد من أن نقص التروية (في الدماغ يمكن أن يسبب الموت العصبي بسبب منع الأكسجين والطاقة وتراكم الكالسيوم داخل الخلايا وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية وضعف الميتوكوندريا والالتهاب.
وقد اقترحت الدراسات الأساسية والسريرية أن الفسيولوجيا المرضية للسكتة الإقفارية ترتبط ارتباطًا وثيقًا بحدوث الالتهاب حيث تلعب الخلايا الدبقية والبلعمية في الجهاز العصبي المركزي دورًا هامًا في ذلك.
وللخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية أصول خلوية مختلفة، حيث تنبع الخلايا الدبيقية الصغيرة من الظهارة العصبية وتعبر عن مستويات عالية من مستقبل الكيموكين1 CX3C (CX3CR1) ومجموعة التمايز(CD) 11b و F4/80 ومستوى منخفض من الـ (CD45) ومستقبل الكيموكين من النوع الثاني (CCR2) وفي المقابل تنشأ الخلايا البلعمية من الخلايا الجذعية المكونة للدم وتعبر الخلايا الوحيدة والخلايا البلعمية الالتهابية عن مستويات عالية من CCR2 و CD11b و Ly6C ، ولكنها منخفضة في مستوى CX3CR1. وفي وجود الالتهاب يمكن تنشيط الخلايا الدبيقية الموجودة في الدماغ والخلايا البلعمية بواسطة السيتوكينات.
في السنوات الأخيرة كشفت الدراسات أن الخلايا النشطة يمكن تصنيفها بشكل إضافي وفقًا لوظائفها المتخصصة. وبشكل عام يتم تصنيف الخلايا الدبيقية إلى؛ النوع النظامي (وهي خلايا تساعد على حدوث الالتهاب مثل الخلايا M1) والنوع البديل (وهو مضاد للالتهابات أو وقائي مثل الخلايا M2).
وقد تتسبب الخلايا الدبيقية من النوع (M1) في زيادة الالتهاب وتسبب إصابة الأنسجة عن طريق إفراز بعض السيتوكينات المؤدية للالتهاب (مثل الإنترلوكين IL -1β، وعامل نخر الورمα ، IL-12 ، IL-23 ، وأول أكسيد النيتروجين) ، وقد يؤدي ممارسة التأثيرات التهابية إلى أن الخلايا M2 الدبيقية تعمل على وقف الالتهاب وتعزيز انتعاش الأنسجة عن طريق إفراز بعض السيتوكينات المضادة للالتهابات (مثل IL-4 ، IL-10 ، IL-13 وعامل النمو المحول β). وعلى غرار الخلايا الدبقية يمكن أن تستقطب الخلايا البلعمية أيضًا أنماطًا مصلية تشبه M1 أو M2.
وفي وجود الإنترفيرونات من الخلايا التائية المساعدة، فإن السكرياتيدات متعددة الدهون أو نمط الضرر المصاحب بالجزيء والخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية تخضع إلى تنشيط في شكل M1، وقد تحث IL-4 / IL-13 على تنشيط في شكل M2 للخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية. وتتميز الاستجابات لشكل M1 بالتنظيم المتطور لـ IL-1β وعامل نخر الورمα وإنزيم سينثاز أكسيد النيتريك المحرض من خلال مستقبل Toll-like 4، واستجابات الـ M2 للتنظيم التصاعدي لإنزيم أرجينازـ CD206 ، CD163 ، IL-4 ، IL-10، وعامل النمو المحول β من خلال تنشيط الخلايا النخاعية. وتشير الدراسات الحديثة إلى أن الخلايا البلعمية M1 يمكن أن تتحول نحو النمط الظاهري للخلايا البديلة النشطة M2 للبلعمة النشطة.
وتكون هذه الفكرة أكثر إقناعا للخلايا البلعمية من الخلايا الدبقية القائمة على وظيفة الخلايا البلعمية وحيدة النواة. النانو هيدروجين هو أبسط جزيء في الطبيعة عديم اللون والرائحة. وبشكل تقليدي يتم استخدام النانو هيدروجين كغاز خامل من الناحية الفسيولوجية في التعمق للوقاية من تخدير النيتروجين لأنه قد لا يتفاعل مع مكونات الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك يمكن أيضًا إنتاج النانو هيدروجين في الأمعاء البشرية ثم طرده عن طريق التنفس.
ولذلك يتم استخدام تركيز النانو هيدروجين من غاز الزفير في تشخيص بعض أمراض الجهاز الهضمي. وفي السنوات الأخيرة تؤكد الدراسات المتزايدة أن النانو هيدروجين يمكن أن يمارس تأثيرات مضادة للأكسدة ومضاد للالتهاب ومضادة لموت الخلايا على مجموعة متنوعة من الأمراض وحيث أن أوهساوا وآخرون ذكرت أن استنشاق النانو هيدروجين يمكن أن يحمي الدماغ ضد إصابة نقص التروية الدماغية عن طريق تحييد انتقائي لشوارد الهيدروكسيل و البيروكسنيتريت. ومع ذلك لا تزال آثار النانو هيدروجين على استقطاب الخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية غير واضحة.
وقد أجريت هذه الدراسة لبحث آثار غاز النانو هيدروجين على استقطاب الخلايا الدبيقية والخلايا البلعمية في المختبر والتي قد توفر آلية جديدة لنشاط النانو هيدروجين المضاد للالتهاب.
المواد والأساليب
الحيوانات
تم شراء الفئران الأم من مركز الحيوان التجريبي التابع للجامعة الطبية البحرية في شنغهاي بالصين (رقم A2015-011) وحفظها في دورة ضوء وإظلام 12/12 وفي درجة حرارة 25 درجة مئوية وتم إعطائها حرية الوصول إلى الماء والغذاء، وتم التضحية بعدد (30 فأر) من الفئران حديثي الولادة سواء كانوا ذكورا أو إناثا في يوم واحد بعد الولادة. وكان كان متوسط وزن الجسم للفئران حديثي الولادة 2.01±0.21جرام، وتمت التضحية هذه للفئران حديثي الولادة من أجل جمع الخلايا الدبيقية والخلايا العصبية الحصينية الأساسية، وتمت الموافقة على بروتوكول الدراسة هذا من قبل لجنة الأخلاق بجامعة الطب البحرية بشنغهاي في الصين (ورقم الموافقة: 20170236).
فصل الخلايا والاستنبات والمراقبة
تم تخدير الفئران حديثي الولادة بمادة ثنائي إيثيل الإيثر، وتم حصاد جذع الدماغ أو أنسجة الحصين وغسلها بمحلول ملحي مخفف من الفوسفات، ثم بعد ذلك تم هضم الأنسجة في الكولاجيناز 0.5 ٪ (سيجما وسانت لويس إم أو، الولايات المتحدة الأمريكية) في درجة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم تم فصل الخليط بواسطة شفطه بالماصة ومن ثم نقله إلى أنبوب طرد مركزي معقم.
تم إضافة وسط من مادة DMEM / F12 بالكامل (يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني 100 بنسيل / 100 مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتوميسين؛ ميرك ميليبور، ألمانيا) وذلك لإيقاف عملية الهضم ثم طرد الناتج المعلق بقوة 1000× جم لمدة 5 دقائق (جهاز طرد مركزي منخفض السرعة – TDZ4B-WS؛ من شركة لو إكسيانجاي المحدودة، شنغهاي، الصين). تمت إزالة المادة الطافية وتمت إعادة تعليق الخلايا المتبقية باستخدام وسط الـ DMEM (هايكولون، لوجان، يوتا، الولايات المتحدة الأمريكية) التي تحتوي على 20٪ من مصل بقري جنيني (الهايكولون) ثم بعد ذلك تم زرعها في قوارير.
تم حفظ خلايا الـ Raw264.7 من قبل مختبر الطب البحري (في شنغهاي، الصين) حيث تم استزراعها في وسط الـ DMEM المضاف إليه المصل البقري الجنيني بنسبة20٪، ثم تم حفظ جميع الخلايا في الحضانة (XBQ-3H ، Hualida Experiment Equipment Co.، Ltd. ، Taicang ، الصين) عند 37 درجة مئوية في بيئة ترطيب مع 5 ٪ CO2. تم تحديث الوسيطة مرة كل 2-3 أيام. لتقييم الآثار الوقائية للهيدروجين ، لوحظت الضامة في 24 ساعة و 72 ساعة و 5 أيام (لايكا DMI3000B ، ألمانيا).
وقد خضع إنشاء نموذج الخلايا العصبية للأكسجين والحرمان من الجلوكوز وجمع المواد الطافية للخلايا العصبية الرئيسية الحصينية الخاصة بالفئران للحرمان من الجلوكوز على النحو التالي: بعد 5 أيام من الاستزراع، تم جمع الخلايا العصبية الأولية مع 90٪ محتشدة بعد إجراء الطرد المركزي لها، ومن ثم تم حفظها في محلول ملحي متوازن (الهايكولون) في حاضنة تحتوي على 5٪ أكسجين و 95٪ نيتروجين في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، وتم جمع المواد الطافية لمعالجة الخلايا الدبيقية الأولية.
تجميع العينات
تم تقسيم الخلايا الدبيقية إلى أربع مجموعات: المجموعة الضابطة (الخلايا الدبيقية الصغيرة) ومجموعة النانو هيدروجين (حيث فيها تعرضت الخلايا الدبيقية إلى النانو هيدروجين بنسبة 60٪ لمدة 24 ساعة)، ومجموعة الحرمان من الجلوكوز (حيث تعرضت الخلايا الدبيقية الصغيرة إلى المادة الطافية من الخلايا العصبية المعالجة بالسكر الجلوكوز لمدة 24 ساعة) ومجموعة الحرمان من الجلوكوز + مجموعة النانو هيدروجين (حيث تعرضت فيها الخلايا الدبيقية إلى المادة الطافية من الخلايا العصبية المعالجة من الحرمان من الجلوكوز وإلى النانو هيدروجين بنسبة 60٪ في وقت واحد لمدة 24 ساعة).
تم تقسيم خلايا الـ (Raw264.7) إلى ثلاث مجموعات: مجموعة ضابطة (خلايا Raw264.7 طبيعية) ومجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون (حيث تتعرض الخلايا Raw264.7 إلى 1 ميكروجرام/مل من السكرياتيدات متعددة الدهون [سيجما الدريخ، سانت لويس ، أم أو، الولايات المتحدة الأمريكية] لمدة 24 ساعة)، وفي مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + مجموعة النانو هيدروجين (تتعرض الخلايا الـ (Raw264.7) إلى 1 ميكروجرام / مل من السكرياتيدات متعددة الدهون وإلى 60٪ من النانو هيدروجين في وقت واحد لمدة 24 ساعة).
التعرض لغاز النانو هيدروجين
وبالنسبة للعلاج بالنانو هيدروجين تم زراعة الخلايا في حاضنة مليئة بالنانو هيدروجين بنسبة 66.7٪ و 33.3٪ من الأكسجين الذي قد تم إنتاجه من جهاز إنتاج النانو هيدروجين (المنتج مع منتج النانو هيدروجينAMS-H-01) )، شنغهاي، الصين)، والذي تم تصميمه لتحليل المياه لإنتاج خليط الغاز، وتم تعريض الخلايا لغاز النانو هيدروجين لمدة 24 ساعة.
التدفق الخلوي (تعداد الخلايا بالجريان)
ويوجد هناك أدلة تظهر أن الالتهاب قد بلغ ذروته في 24 ساعة بعد السكتة الإقفارية. لذلك تم جمع خلايا الـ (Raw264.7) في كل مجموعة خلال الـ 24 ساعة والـ72 ساعة و 5 أيام، وتم جمع الخلايا البلعمية خلال 24 ساعة وتم غسل الخلايا بمحلول الفوسفات الملحي المخفف البارد ثلاث مرات ثم إجراء الطرد المركزي لها، وتمت إزالة المادة الطافية وتم إعادة تعليق الخلايا في محلول ملحي مخفف بالفوسفات بكثافة 1 × 105 خلية/مل.
وبعد ذلك تم تثبيت الخلايا في واقي تثبيت في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم إجراء الطرد المركزي عند 1000×جرام لمدة 5 دقائق. وبعد غسل الخلايا في ألبومين المصل البقري بنسبة 2٪ تم تحضين الخلايا في الظلام بالأجسام المضادةCD11b-FITC من شركة (بيوليجيند، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) والأجسام المضادةCD16 / 32-PE من شركة بيوليجيند لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 4 درجة مئوية للخلايا البلعمية M1؛ وتم تحضين الخلايا في الظلام بالأجسام المضادة CD11b-FITC و CD206-APC من شركة بيوليجند لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية للخلايا البلعمية M2. وبعد غسل الخلايا في ألبومين المصل البقري بنسبة 2٪ تم تعليق الخلايا في 300ميكرولتر من محلول الفوسفات المخفف ومن ثم تم جمعه لقياس التدفق الخلوي (B & D للعلوم البيولوجية، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية).
التحليل الإحصائي
تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج سيجمابلوت11.0 (شركة سيستات للبرمجيات، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). يتم التعبير عن البيانات كمتوسط الانحراف المعياري ±، وتم إجراء المقارنات مع تحليل التباين أحادي الاتجاه بين المجموعات متبوعاً باختبار كيولس نيو مان للطالب، والذي فيه تعتبر القيمة (P<0.05) ذات دلالة إحصائية.
النتائج
مورفولوجيا الخلايا ومعدل النمو
كما هو مبين في الشكل 1 نرى أنه قد نمت خلايا الـ (Raw264.7) الطبيعية مع التمسك الثابت وانتشرت بسرعة وكانت مستديرة الشكل. وبعد معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون، أصبحت معظم الخلايا Raw264.7 في شكل مغزلي، وتراجع معدل النمو مع مرور الوقت، وتم عد الخلايا أيضاً. وفي اليوم الثالث زاد عدد خلايا الـ(Raw264.7) بشكل ملحوظ في مجموعة الضابطة (بمعدل النمو: 95.40 ٪)، إلا أن نمو الخلايا في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون انخفض بشكل كبير إلى (20.51٪) بالمقارنة مع نسبة نمو الخلايا في المجموعة الضابطة (P <0.05).
وفي اليوم الخامس كان نمو الخلية في المجموعة الضابطة 1.9 مرة لليوم الثالث، وظل نمو الخلايا في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون عند مستوى منخفض (أي بنسبة 27.66٪، P<0.05، مقابل المجموعة الضابطة). في وجود النانو هيدروجين بنسبة 60٪ خلال معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون، ظلت مورفولوجيا الخلية دون تغيير نسبي واستعادت أيضاً معدل النمو بشكل جزئي أيضا. وكان عدد الخلايا في اليوم الثالث 2.85 مرة مثل اليوم الأول وكان عدد الخلايا باليوم الخامس 1.17 مرة مثل اليوم الثالث (P <0.05 ، مقابل المجموعة الضابطة؛ P <0.05 مقابل مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون). وقد لوحظ أن معدل نمو الخلايا في اليوم الخامس في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + النانو هيدروجين أقل من مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون، على الرغم من أن إجمالي عدد الخلايا في اليوم الخامس في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + النانو هيدروجين كان لا يزال أكبر مما كان عليه في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون.
النمط الظاهري للخلية Raw264.7
في المجموعة الضابطة ظلت نسبة الخلايا البلعمية (M1) مستقرة في فترات زمنية مختلفة (الشكل2). وعلى الرغم من أنه قد تم زيادة معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون بشكل كبير زادت نسبة الخلايا البلعمية (M1) بناء على الوقت (P<0.05، مقابل المجموعة الضابطة). في وجود النانو هيدروجين مع معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون وجد أن نسبة الخلايا البلعميةM1 قد انخفضت بشكل ملحوظ عند مقارنتها بمجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون(P<0.05) من اليوم الأول فضلا عن أنه لم يكن هناك اختلافات واضحة في نسبة الخلايا البلعمية (M1) بين المجموعة الضابطة ومجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + النانو هيدروجين (P>0.05)، على الرغم من أن نسبة الخلايا البلعمية (M1) في مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون + مجموعة النانو هيدروجين كانت أقل مما كانت عليه في المجموعة الضابطة.
وانخفضت نسبة الخلايا البلعمية (M2) في المجموعة الضابطة مع مرور الوقت وانخفضت أيضا في معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون نسبة الخلايا البلعمية (M2) [P<0.05، مقارنة بالمجموعة الضابطة) (الشكل 3). ومع ذلك فإن إضافة غاز النانو هيدروجين أثناء معالجة السكرياتيدات متعددة الدهون لم تنجح في زيادة نسبة الخلايا البلعمية (M2) إلى المستوى الطبيعي (P <0.05، مقارنة بالمجموعة الضابطة)، ولم يكن هناك اختلافات واضحة بين مجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون ومجموعة السكرياتيدات متعددة الدهون+ النانو هيدروجين. بالإضافة إلى أنه قد انخفضت نسبة الخلايا البلعمية (M2) مع مرور الوقت في جميع المجموعات.
النمط الظاهري للدبيقات
في المجموعة الضابطة كانت نسبة الخلايا الدبيقية (M1) منخفضة نسبيًا عند 24 ساعة (كما في الشكلان 4 و 6)، وظلت عند مستوى منخفض في مجموعة النانو هيدروجين (P> 0.05). ومع ذلك فإن الطائفات من الخلايا العصبية المعالجة بالحرمان من الأكسجين والجلوكوز أظهرت زيادة كبيرة في نسبة الخلايا الدبيقية (M1) بها مقارنة بالمجموعة الضابطة (P <0.05)، وفي وجود النانو هيدروجين أثناء العلاج الطافٍ انخفضت نسبة الخلايا الدبيقية (M1) إلى المستوى الطبيعي تقريبا مقارنة بالمجموعة الضابطة (P> 0.05).
ظلت نسبة الخلايا الدبيقية (M2) مستقرة في كل مجموعة ولم يكن هناك اختلافات إحصائية بين المجموعات التجريبية والمجموعة الضابطة (كما هو موضح في الشكل 5 و 6). ومع ذلك، فإن نسبة الخلايا الدبيقية (M2) تميل إلى الزيادة في مجموعة المعالجة بالحرمان من الأكسجين والجلوكوز وبدا أنه ينخفض في مجموعة النانو هيدروجين، وانخفضت نسبة الخلايا البلعمية (M2) قليلا عند إضافة النانو هيدروجين أثناء العلاج بالحرمان من الأكسجين والجلوكوز.
المناقشة
إن السكتة الدماغية هي حالة طبية طارئة قد تتسبب في عجز عصبي مدمر. وحتى الآن كانت السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي للوفاة والإعاقة للبالغين في جميع أنحاء العالم. وعلى الرغم من أن المسبب المرضي في السكتات الدماغية معقد (وهو نوع رئيسي من السكتة الدماغية)، فقد أكدت بعض الدراسات على أهمية دور الالتهاب في التسبب في السكتة الدماغية الإقفارية. وتساهم الاستجابة للالتهاب في إحداث أضرار عصبية ثانوية والتي تمارس تأثيراً جوهرياً على كل من الإصابات بالسكتات الدماغية الإقفارية الحادة والتعافي المستمر لوظيفة الدماغ، وإن الالتهاب الناتج عن نقص التروية بالدماغ لديه تدخل لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البلعمية أحاديات الخلايا المشتقة في الجهاز العصبي المركزي، حيث أن الخلايا الدبقية هي الخلايا المناعية الموجودة في الدماغ.
فبمجرد حدوث نقص التروية الدماغية يتم تنشيط الخلايا الدبقية لإنتاج كل من وسائط الوقاية العصبية والوسائط الضارة ويحدد توازن الوسائط المختلفة مصير الأعصاب المصابة، ويعرف تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بالخلايا النظامية (M1) أو البديلة (M2)، والتي تتوافق مع التأثيرات الضارة والوقائية لهذه الخلايا على التوالي. وفي هذه الدراسة تم تناول الخلايا البلعمية والخلايا الدبقية الصغيرة بشكل مستقل. وتم استخدام غاز النانو هيدروجين كغاز خامل من الناحية الفيزيائية في الدراسة المتعمقة ولكن كشفت الدراسات المتزايدة في السنوات الأخيرة عن أن غاز النانو هيدروجين له بعض الأنشطة الفسيولوجية يمكن أن تحدث تأثيرات وقائية لمجموعة متنوعة من الأمراض. على الرغم من أن التأثير المضاد للالتهاب للهيدروجين قد تم فحصه في العديد من النماذج إلا أن آلية عمله المحددة لا تزال غير مفهومة.
يرتبط استقطاب الخلايا البلعمية ارتباطا وثيقا بحدوث الالتهاب ولكن هناك نقص في الأبحاث حول دور النانو هيدروجين في استقطاب الخلايا البلعمية. وفي هذه الدراسة تم بحث آثار النانو هيدروجين على استقطاب الخلايا البلعمية والخلايا الدبقية الصغيرة (والذين يعدو من أهم المشاركين في حدوث السكتة الدماغية الإقفارية). وقد استخدمت معالجة الخلايا البلعمية بالسكريات متعددة الدهون كنموذج التهاب قياسي.
وأظهرت النتائج زيادة كبيرة في نسبة الخلايا البلعمية (M1) في السكاريدات متعددة الدهون وانخفاض في الخلايا البلعمية (M2) في نفس الوقت ولكن النانو هيدروجين استطاع أن يقلل بشكل ملحوظ من الخلايا البلعمية (M1) من اليوم الأول وكان له تأثير ضئيل على الخلايا البلعمية (M2).
وتشهير هذه النتائج إلى أن السكرياتيدات متعددة الدهون قد تنشط الخلايا البلعمية والتي تتميز بزيادة في الخلايا البلعمية (M1) السابقة للالتهابات، ولكن لها تأثير ضئيل على الخلايا البلعمية المضادة للالتهابات (M2). وهذا بالإضافة إلى أن المعالجة بالنانو هيدروجين وحده ليس له أي تأثير على استقطاب الخلايا البلعمية.
وهذا هذه يشير إلى أن النانو هيدروجين يؤثر فقط على النمط الظاهري للخلايا البلعمية تحت الحالة المسببة للمرض، ويعزي الانخفاض في الخلايا البلعمية (M1) إلى تثبيط نشاط الخلايا البلعمية ولكن بدون تحول من النمط الظاهري M2 إلى النمط الظاهري M1.
ويوجد هناك أدلة تظهر أهمية التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا العصبية و الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق السكتة الدماغية الإقفارية. وقد وجد إنوز وآخرون بأن السكرياتيدات متعددة الدهون من الخلايا العصبية المجاورة يمكنها تنشيط الخلايا البلعمية في منطقة السكتة الدماغية الإقفارية.
وأظهرت دراسة زهاو وآخرون بأن الإنترليوكين-4(IL-4) من الخلايا العصبية بمثابة مغير لمسارات الخلايا البلعمية وهكذا فإن الخلايا الدبقية المعرضة للمادة الطافية من الخلايا العصبية المعالجة بمنع الأكسجين والجلوكوز كانت بمثابة نموذج للإصابة بنقص تروية الدماغ في هذه الدراسة. وقد أظهرت نتائجنا أن المادة الطافية من الخلايا العصبية المعالجة بالأكسجين والجلوكوز يمكن أن تزيد من نسبة الخلايا البلعمية (M1)، ولكن في نفس الوقت يثبط العلاج بالنانو هيدروجين زيادة هذه الخلايا. ومع ذلك لم يكن للمادة الطافية والنانو هيدروجين تأثير كبير على الخلايا البلعمية (M2).
وكانت لهذه الدراسة العديد من القيود؛ أولا تم استخدام السكريدات متعددة الدهون لتحفيز الخلايا البلعمية كما في النموذج الالتهابي، والتي قد تختلف في الجسم الحي وبالتالي سيتم حل نقص أبحاث الأجسام الحية في المستقبل. وفي دراستنا هذه قمنا باستخدام خطوط الخلايا ولكن ليس الخلايا البلعمية الرئيسية وكشفنا فقط الخلايا الدبقية في 24 ساعة.
يمكن أن تزيد السكريدات متعددة الدهون بشكل كبير من الخلايا البلعمية المسببة للالتهاب ويمكنها رفع نسبة الخلايا البلعمية المسببة للالتهاب في طافيات الخلايا العصبية المعالجة بمنع الأكسجين والجلوكوز، ولكن كلا من العلاجين لهما تأثيرا ضئيلاً على الخلايا البلعمية المضادة للالتهاب. بالإضافة إلى أن المعالجة المتزامنة بالنانو هيدروجين تثبط زيادة الخلايا البلعمية المسببة للالتهابات وليس لها أي تأثير على الخلايا المضادة للالتهاب.
وهذا يوفر آلية جديدة للتأثير المضاد للالتهابات الخاص بالنانو هيدروجين. ومع ذلك، هناك حاجة لمزيد من الدراسات لتأكيد النتائج التي توصلنا إليها والتحقق أكثر في المسارات المحددة الكامنة وراء الاستقطاب المنظم للهيدروجين للخلايا البلعمية.
ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ
المصدر : مجلة أبحاث الغاز الطبي
الموقع : http://www.medgasres.com
رابط البحث :http://www.medgasres.com/article.as...ume=8;issue=4;spage=154;epage=159;aulast=Ning